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2014-12-29 09:33 |
PCR技术三十周年纪
上世纪八十年代Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，如今DNA扩增俨然已经成为了生物学研究的基础。今年正值PCR技术诞生三十周年，让我们看看如今的PCR是个什么模样。
三十年来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改进，催生出了越来越多的新研究工具。如今PCR技术早已走出实验室，在遗传学鉴定和疾病诊断中发挥着巨大的作用，在越来越广阔的领域里焕发着新的活力。
高保真酶
PCR技术长盛不衰的秘诀之一就是，以模板为基础合成新链的DNA聚合酶一直在不断地发展。“自PCR技术诞生以来，PCR的进步很大程度上依赖于酶学的发展，”Thermo Scientific的产品经理Edita Smergeliene说。现在我们已经难以想象，没有自动化PCR仪也没有热稳定聚合酶的原始PCR实验。当年的研究人员得亲手控制样品温度，将新鲜的DNA聚合酶添加到每个循环中。从源自E. coli的原始DNA聚合酶，到更耐热但易出错的Taq酶(源于Thermus aquaticus)，再到不易出错的校读型DNA聚合酶，人们在不断改造着PCR酶以满足日益增长的特殊需求。
如今“高保真”DNA聚合酶设计得更为精益求精。例如Thermo Scientific公司的Phusion高保真DNA聚合酶，将具有校读功能的古细菌酶与耐热的DNA结合蛋白融合在一起。“这种结合蛋白能增强聚合酶与双链DNA的亲和力，”Smergeliene说。“Phusion的强劲性能及其高超的持续合成能力，使其特别耐受PCR抑制剂，可以在标准聚合酶无能为力时大显身手。”EMD Millipore公司的KOD高保真DNA聚合酶特别适用于PCR的新应用领域，例如二代测序(NGS)和生物学合成等。“我们的PureGenome™ 二代测序试剂盒就采用了KOD 高保真DNA聚合酶，能够有效降低NGS文库制备中的偏好。对于以PCR为基础的高通量测序来说，偏好性是一个很普遍的问题，”EMD Millipore公司的基因组产品经理Ayaz Majid说。
NEB公司去年刚推出的新产品Q5超保真DNA聚合酶，融合了Sso7d DNA结合域。该产品将延伸时间缩短到了10秒/ kb，而且其保真度比Taq酶高100倍。此外，Bio-Rad公司的高保真PCR试剂也采用了DNA结合蛋白Sso7d。他们将其与有校读活性的聚合酶融合，这种iProof DNA聚合酶能够对困难的长目标实现快速扩增，还能耐受一些样本中的PCR抑制剂。
在如今多样化的PCR应用中，早已无法一“酶”走遍天下。Kapa Biosystems公司开始采用高通量的定向方法，来为特殊PCR应用设计专门的DNA聚合酶，例如NGS。“我们在大量特殊蛋白中进行筛选，寻找能大大增强酶功能的突变体，”Kapa Biosystems的技术指导John Foskett说，他专门为NGS文库扩增设计了高保真的KAPA HiFi DNA聚合酶。“这一产品几经优化，能够有效降低PCR带来的偏好并且提高产量，从而得到更为一致的测序覆盖度，增加文库的复杂程度。”
百里挑一
在PCR诞生初期，可供选择的聚合酶非常有限。不过时至今日，在进行PCR实验之前，五花八门的酶就足以闪花我们的双眼。没的选让人无奈，选择太多又令人头疼，这该如何是好?
大多数专家在选择PCR试剂时，主要考虑的是自己的实验应用和样品的内在性质。如果关键在于扩增产物的测序精确性，那么就应选择高保真酶。同样，也有相应产品适用于扩增特别长的DNA目标。“DNA重复序列会给PCR扩增带来难度，例如TA重复。复杂的二级结构也会给扩增带来麻烦，例如复含GC的重复序列，”Majid说。“这时你就需要性能强劲的酶和适宜的缓冲条件，来克服挑战性的模板。”在这种情况下，NEB的Q5超保真DNA聚合酶和EMD-Millipore的KOD Xtreme™ DNA聚合酶都是不错的选择。
如果需要特别防范意外突变，那么最好使用带有校读能力的酶。若是想要得到高产量的DNA用于芯片检测或NGS，就需要持续合成能力强延伸速度快的酶，例如EMD Millipore家的高保真KOD DNA聚合酶，或者Thermo家的Phusion高保真DNA聚合酶。此外，热启动的DNA聚合酶能够显著提升PCR反应的特异性，并且适用于自动化系统。
常规DNA聚合酶和高保真DNA聚合酶该如何取舍，往往令人感到困惑。一般来说，对于那些只需快速核对序列的常规PCR，或者对某个克隆步骤的鉴定，是不需要高保真酶的，缺乏3-5'外切酶活性的常规酶就足够了。不过，特异性和敏感度较高的酶更有利于对低量DNA进行扩增。
市面上DNA聚合酶种类繁多，看得久了难免无所适从。Kapa Biosystem公司的John Foskett一针见血地指出，我们实际上面临的选择只有两种。“尽管市面上的PCR试剂琳琅满目，不过从根本上来说就是两类：tag或校读型酶，tag及校读型酶，”他说。“PCR试剂间任何性能上的差异，主要是来自于缓冲液或酶浓度的改变，在蛋白质水平上并没有根本性的差异。”
PCR之变
数字PCR是本领域最激动人心的创新之一，这一技术能够对样品中的DNA分子数进行绝对定量。目前可以进行数字PCR的平台包括：Life Technologies公司的QuantStudio™ 3D数字PCR系统，Bio-Rad公司的QX100微滴式数字PCR(ddPCR)系统，Fluidigm公司的qdPCR 37K™ IFC系统，以及RainDance Technologies的RainDrop数字PCR系统。绝大多数数字PCR系统的工作原理是，将DNA样品分成大量微小液滴，每个液滴中只含有不超过一个DNA分子，然后再进行计数。据Bio-Rad公司的ddPCR商品化市场经理James Lee介绍，“数字PCR大大提高了灵敏度和精确性，因此ddPCR特别适用于绝对定量、检测拷贝数变异和罕见事件。”Life Technologies的基因分析高级市场开发经理Angelique Habis称，数字PCR具有广阔的应用前景，例如检测癌症样本中的罕见靶标，检测病原体，病毒载量的绝对定量，NGS文库的质控等等。
直接PCR是PCR领域的又一大创新，该技术无需通常的DNA纯化步骤，可以直接在收集到的样品上进行PCR(如组织和血液)。这要归功于化学领域的突破，“为了能够在这样的条件下进行扩增，聚合酶必须对样品中的PCR抑制剂有相当强的抵抗力，这样的抑制剂包括血液成分等，”Smergeliene说。“持续合成能力强的DNA聚合酶(如Phusion或Phire酶)就具有这样的额外特性，这也是Thermo Scientific直接PCR试剂盒的核心。”此外，EMD Millipore的KOD Xtreme聚合酶也是为检测原始样品而设计的。
PCR仪之变：随着技术的进步，人们也在不断改进PCR仪的性能。例如，减少PCR所需的样品体积，以便节省宝贵的罕见材料，降低试剂成本，并且减少废弃物对环境的影响。此外，PCR仪的设计重点还在于提高反应效率，同时节省实验室空间。举例来说，Thermo Scientific公司Piko PCR仪的反应体积可以低至5 μL，该公司还提供超薄的微孔板和小管以便达到更好的热传递效果，降低能源的消耗。“该仪器小巧轻便而且噪音低，能帮助用户大大节省时间、试剂、空间和能源，”Thermo Fisher Scientific的产品经理Kari Kataja说。有的PCR仪厂家继续在提高PCR的精确度和可重复性上下功夫，例如Eppendorf。“我们的热模块温度精确性高，均一性好，而且能减少样品的蒸发，”Eppendorf产品经理Kay Koerner说。
三十年前的人们一定无法想象PCR技术今天的模样，而三十年后的今天PCR技术仍在不断的发展。“三十年前，没人料到DNA复制这样一个简单的概念，会对生物学和人类健康带来如此大的转变，”Foskett说。“现在，高灵敏度低偏好性的全基因组扩增方法，使单细胞基因组分析得以实现，而这将大大推动胚胎植入前遗传学筛查等领域的发展。”人们常说“三十而立”，PCR也在其三十岁生日之际进入了全盛期，开始向人们展示它的真正力量。
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